Опн расшифровка энергетика: Назначение и расшифровка ограничителей перенапряжений

EPA ищет помощи общественности в расшифровке закона Браунфилдса 2018 г.

EPA ищет помощи общественности в расшифровке недавнего закона, затрагивающего ответственность местных властей и властей штата за зараженные участки.

Закон BUILD, вступивший в силу в 2018 году, повторно санкционировал Программу Brownfields Агентства по охране окружающей среды и изменил условия для нефедеральных правительств, чтобы избежать ответственности при приобретении загрязненных участков.Но в языке, установленном Конгрессом, некоторые термины не имеют четкого значения, заявила Синди Маки, курирующая программу EPA Superfund принуждение к исполнению закона, на конференции Brownfields агентства в Лос-Анджелесе 11 декабря.

EPA обращается к властям штата и местным властям. чтобы взвесить то, что они делают с зараженными сайтами, чтобы избежать ответственности, и какие опасения они испытывают по поводу ответственности за сайт, сказал Крейг Бор, советник-юрист Управления по исправлению и защите сайтов Агентства по охране окружающей среды, во время онлайн-сеанса слушания декабря.18.

Согласно новому закону, государство или местное правительство, которое приобрело участок «в силу своей суверенной функции», не будет нести ответственности.

«Как это понимать? Я задаю вопрос, и я работала над этим законодательством », — сказала на конференции Сьюзан Бодайн, помощник администратора EPA по обеспечению соблюдения и соблюдению требований.

Как только агентство сможет переводить язык, оно выпустит руководство для затронутых сторон, сказал Макки на конференции.

Предыдущий отказ также неясен

Предыдущие формулировки отказались от ответственности для государственных и местных органов власти, которые недобровольно приобрели собственность, что также было неясно этим сторонам, Мэтью Сандер, также поверенный-советник в Управлении по исправлению положения на объектах и ​​правоприменению EPA, сказал во время сеанса прослушивания 18 декабря.

По словам Сандера, некоторые методы приобретения собственности до сих пор не признаны законом, включая пожертвования и приобретение выдающихся доменов.

Стороны, заинтересованные в приобретении загрязненной собственности или земли, прилегающей к загрязненной собственности, могут быть обеспокоены тем, что несут ответственность за токсичные вещества на участке. У EPA есть несколько средств для решения проблем, связанных с ответственностью сторон.

«Местное приобретение было проблемой с начала 90-х», — сказала Джуди Шихан, заместитель исполнительного директора по окружающей среде на Конференции мэров США, во время сеанса прослушивания. «Несмотря на то, что мы прошли долгий путь, мы надеялись, что закон« СТРОИТЕЛЬСТВО »закрепит этот успех.

Агентство принимает комментарии по электронной почте до 15 января.

Агентство по охране окружающей среды начало Программу Браунфилдс в 1995 году для предоставления грантов на очистку и реконструкцию собственности, где присутствуют или потенциально присутствуют загрязнители. Закон о старых месторождениях, также известный как Закон о смягчении ответственности малого бизнеса и возрождении старых месторождений 2002 года, расширил техническую и финансовую помощь для восстановления территорий.

Имитационное исследование влияния свойств нейронного ансамбля на алгоритмы декодирования для интракортикальных интерфейсов мозг-машина

Задний план: Интракортикальные интерфейсы мозг-машина (ИМТ) используют информацию о движениях, считывая активность нейронов с помощью хронических микроэлектродных имплантатов, чтобы восстановить утраченные функции у пациентов с параличом.Однако нейронные сигналы часто меняются со временем, даже в течение дня, вынуждая человека восстанавливать ИМТ каждый раз, когда они его оперируют. Термин «восстановление» означает общие процедуры для работы с BMI, такие как выбор декодера, обучение декодера и тестирование декодера. Это порождает практический вопрос о том, какой декодер следует построить для данного ансамбля нейронов. Это исследование направлено на решение этой проблемы путем изучения того, как производительность декодеров зависит от свойств нейронов. Чтобы всесторонне изучить ряд нейронных свойств, мы проводим имитационное исследование.

Методы: Сосредоточившись на направлении движения, мы исследуем несколько основных свойств нейронов, включая отношение сигнал / шум нейронов, долю хорошо настроенных нейронов, однородность их предпочтительных направлений (PD) и нестационарность PD. Мы исследуем производительность трех популярных декодеров BMI: фильтр Калмана, оптимальная линейная оценка и алгоритм вектора популяции.

Результаты: Результаты нашего моделирования показали, что на производительность декодирования всех декодеров больше влияет доля хорошо настроенных нейронов, а не их однородность.

Выводы: Наше исследование предлагает смоделированный сценарий того, как выбрать декодер для интракортикального ИМТ в различных нейронных состояниях.

Механизм расширения декодирующей способности тРНК модификацией уридинов

Nat Struct Mol Biol. Авторская рукопись; доступно в PMC 2010 3 февраля.

Опубликован в окончательной редакции как:

PMCID: PMC2816034

EMSID: UKMS27935

Albert Weixlbaumer

¹ MRC Laboratory of Molecular Biology, CB2 Road, Hills 2 UK

Frank V. Murphy, IV

¹ MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, UK

Agnieszka Dziergowska

² Институт органической химии, Технический университет Лодзи, ул.116, Лодзь, Польша

Анджей Малкевич

² Институт органической химии Лодзинского технического университета, ул. Зеромского, 116, Лодзь, Польша

Franck AP Vendeix

^{3 , Университет штата Северная Каролина, Роли, Северная Каролина 27695-7622, ​​США}

Пол Ф. Агрис

³ Департамент молекулярной и структурной биохимии, Университет штата Северная Каролина, Роли, Северная Каролина 27695-7622, ​​США

V .Рамакришнан

¹ MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, UK

¹ MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, UK

² Institute of Technical Organic Chemistry Университет Лодзи, ул. Зеромского, 116, Лодзь, Польша

³ Департамент молекулярной и структурной биохимии, Государственный университет Северной Каролины, Роли, Северная Каролина 27695-7622, ​​США

Дополнительные материалы

sup рис. 1.

GUID: 380E7EF3-A719-4A56-B3EA-D2E8B8E18052

supp рис 2.

GUID: 3E8BAC-

GUID: 3E8BAC-

—

Supp fig 3.

GUID: E2D66DB5-04B7-4212-AEDE-50BB9F342E2C

Supp info title.

GUID: FE9F4121-28FE-4759-90B9-B620101C787B

Abstract

Одной из наиболее распространенных модификаций оснований, участвующих в декодировании, является уридин 5-оксиуксусная кислота в положении колебания тРНК.В течение нескольких десятилетий было известно, что эта модификация позволяет одной тРНК декодировать все четыре кодона в вырожденном кодоновом боксе. Мы определили структуры стебля-петли антикодона тРНК ^Val , содержащей модифицированный уридин со всеми четырьмя кодонами валина в кодирующем сайте 30S рибосомной субъединицы. Внутримолекулярная водородная связь, включающая модификацию, помогает предварительно структурировать петлю антикодона. Мы видим необычные пары оснований с тремя некомплементарными кодонными основаниями, включая пару оснований GU в стандартной геометрии Уотсона-Крика, которая предположительно включает енольную форму уридина.Эти структуры предполагают, как модификация уридина в положении колебания может расширить декодирующую способность тРНК.

ВВЕДЕНИЕ

Считается, что примитивный генетический код мог быть двухбуквенным кодом с вырожденной третьей позицией в кодоне ¹ . Однако существующий генетический код развился так, что только 8 из 16 кодоновых блоков полностью вырождены, то есть кодируют одну и ту же аминокислоту (). Такие блоки вырожденных кодонов обычно декодируются разными изоакцептирующими тРНК ² .Четырехкратный вырожденный блок кодонов для валина декодируется двумя разными тРНК E.coli , тРНК ^Val _GAC и тРНК ^Val _cmo5UAC (где указан антикодон). Тем не менее, валин может быть включен в белок оболочки MS2 из всех четырех его кодонов, используя только одну тРНК ³ . Посттранскрипционная модификация уридина до уридин-5-оксиуксусной кислоты (cmo ⁵ U) в позиции колебания 34 позволяет тРНК ^Val _cmo5UAC и тРНК ^Pro _cmo5UGG эффективно читать A, G и U 90. in vitro и требуется для распознавания A, G, U и C in vivo в мутантных штаммах, лишенных других изоакцепторов ^{4 — 6} .Учитывая его важность в расширении возможности декодирования различных кодонов, неудивительно, что положение вобуляции U34 модифицируется на cmo ⁵ U34 или его производные (дополнительный рис.1 онлайн) для тРНК, распознающих кодоны в шести разных кодоновых боксах ( ), что делает эту одну из наиболее широко используемых модификаций тРНК, непосредственно участвующих в декодировании.

Вырождение генетического кода. (а) Генетический код. 8 из 16 кодоновых боксов являются вырожденными (выделены зеленым и белым).Блоки кодонов, в которых можно найти cmo ⁵ U34 или производные, выделены зеленым. (b) Спаривание между ASL и кодоном на мРНК. Модификация позволяет тРНК читать A, G, U и в некоторых случаях также C. (c) Модифицированные основания, присутствующие в E. coli тРНК ^{Val (cmo5UAC)} . Изменения выделены красным. Ожидается, что для cmo ⁵ U модификация повлияет на кето-енольное равновесие.

Предыдущие кинетические и структурные исследования показали, что селекция тРНК рибосомой включает индуцированное приспособление к продуктивной форме, что позволяет активировать дополнительный фактор GTPase EF-Tu ^{7 , 8} .Во время декодирования геометрия спаривания оснований Уотсона-Крика между кодоном и антикодоном в первых двух положениях отслеживается посредством взаимодействий малых бороздок с помощью рибосомных оснований A1492, A1493 и G530 (нумерация E. coli ) ⁹ . Это распознавание обеспечивает дополнительную энергию связывания, чтобы вызвать переход рибосомы из открытой в закрытую форму, которая требуется для отбора тРНК ¹⁰ . Однако антибиотики или мутации, которые делают переход более энергетически благоприятным, могут сделать возможным отбор близкой к родственной тРНК.С другой стороны, образование пар оснований Watson-Crick в первых двух положениях не всегда достаточно для декодирования, и предыдущие структурные исследования показали, как модификации в лизиновой тРНК играют важную роль ¹¹ .

Здесь мы сообщаем о кристаллических структурах петли стебля антикодона (ASL ^Val _cmo5UAC ), связанной со всеми четырьмя кодонами валина в декодирующем сайте 30S рибосомной субъединицы. Недавняя структура рибосомы ¹² с высоким разрешением показывает, что ASL полноразмерной тРНК устанавливает практически идентичные контакты во всей рибосоме с теми, которые изолированный ASL делает с 30S субъединицей ⁹ , таким образом подтверждая исследования с использованием кристаллов Субъединица 30S с ASL для изучения взаимодействий тРНК в сайте A.Эти структуры выявляют необычное спаривание оснований в положении колебания и проливают свет на то, как модификация уридина позволяет расширенное декодирование с помощью тРНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Помимо cmo ⁵ U34, ASL содержал сопутствующую модификацию N6-метиладенозин (m ⁶ A37) в позиции 37 () ² . ASL и олигонуклеотиды, соответствующие каждому из четырех кодонов валина, пропитывали кристаллами 30S субъединицы рибосомы, и их структуры определяли, как описано ранее ⁹ (см. Методы).Четыре структуры были улучшены до разрешения от 2,8 до 3,1 Å. Обе модификации четко видны на всех четырех несмещенных разностных картах Фурье ASL ^Val _cmo5UAC , привязанных к GU (A / G / U / C). Структуры показывают необычное и неожиданное спаривание оснований только в положении колебания (и дополнительный рис. 2 онлайн).

cmo ⁵ U образует пары оснований для всех четырех оснований в положении качания. Четыре пары оснований между cmo ⁵ U34 и колеблющимся основанием мРНК наблюдаются в четырех структурах вместе с несмещенными разностными картами Фурье.Указаны водородные связи между основаниями. (а) cmo ⁵ U34-A; б смо ⁵ У34-Г; c cmo ⁵ U34-U; (г) см ⁵ U34-C. Этот и другие рисунки молекулярной графики были сделаны с помощью PyMOL ³⁵ .

Во всех четырех структурах глобальная конформация субъединицы 30S и взаимодействия в первых двух парах оснований кодон-антикодон очень похожи на те, которые описаны для родственной тРНК ^{Phe 9} .Нуклеотид кодона в положении вобуляции ограничен водородными связями с G530 16S рРНК и через мостик, опосредованный Mg ²⁺ , с C518 и рибосомным белком S12 ⁹ . Однако антикодон ASL ^Val _cmo5UAC более ограничен, чем в случае немодифицированного основания, потому что эфирный кислород (O5) cmo ⁵ U34 образует внутримолекулярную водородную связь во всех четырех парах оснований с 2′-ОН U33 (). В этом ASL 2′-OH U33 также находится в пределах расстояния водородных связей N7 A35.Рибоза cmo ⁵ U34 принимает конформацию C3′- endo во всех четырех структурах.

Сравнение cmo5U-G со стандартным колебанием U-G. (a) Водородная связь от 2’OH U33 до O5 модификации. Этот контакт препятствует боковому перемещению cmo ⁵ U. (b) Геометрия наблюдаемой пары оснований cmo ⁵ U34-G. (c) Базовая пара U-G-колебания показана, если бы она была в стандартной геометрии колебания. Обратите внимание, что U будет полностью разложен.

Модификация не играет очевидной роли в канонической паре cmo ⁵ U34-A, которая принимает нормальную геометрию Ватсона-Крика. Cmo ⁵ U34 хорошо упорядочен и принимает определенную ориентацию, в которой карбоксильная группа указывает на основную цепь противоположной цепи ().

Базовая пара cmo

Удивительно, но базовая пара cmo ⁵ U34-G принимает геометрию Уотсона-Крика, предполагая, что U должен быть в енольной форме.Кристаллическая структура 5-метоксиуридина показала увеличение длины связи C4-O4, а также уменьшение длины связи N3-C4, что указывает на сдвиг кето-енольного равновесия основания ¹³ (). Это изменение длин связей было более выраженным, чем в 5-гидроксиуридине, указывая на то, что сдвиг в равновесии зависит от электронных и стерических свойств группы, присоединенной к C5 ¹³ . Мы предполагаем, что, кроме того, спаривание cmo ⁵ U34 с G индуцирует и стабилизирует енольную форму.В подтверждение этого теоретические исследования предсказали, что глицин вызывает аналогичный таутомерный сдвиг в U, который может увеличивать концентрацию енольной формы до 5 порядков величины ¹⁴ .

Пары оснований пиримидин-пиримидин

Пара оснований cmo ⁵ U34-U имеет более широкую малую бороздку, приводящую только к одной водородной связи (и), в форме спирали A-формы, аналогичной ранее наблюдаемым парам UU ^{15 , 16} . Мы не наблюдаем упорядоченную молекулу воды, соединяющую N3 cmo ⁵ U34 с O2 U3, что позволяет предположить, что N3 по крайней мере частично десольватирован.Было показано, что G530 контролирует вторую пару оснований антикодон-кодон, образуя контакты с 2′-ОН антикодона через его N3 и 2′-ОН. В паре оснований cmo ⁵ U34-U рибоза G530 принимает конформацию C2′- endo , тем самым располагая его 2′-OH ближе к O2 и 2′-OH cmo ⁵ U34, но все же поддержание водородной связи между его N3 и 2′-OH в A35 в ASL (). Эти дополнительные взаимодействия, возникающие в результате модификации, по-видимому, более чем компенсируют в противном случае необходимую десольватацию O2 cmo ⁵ U34.Интересно, что карбоксильная группа модификации находится на расстоянии водородных связей от O4 U на мРНК ().

Две пары оснований пиримидин-пиримидин. (а) Альтернативные конформации рибосомного основания G530. В паре оснований cmo ⁵ U-U рибоза G530 принимает конформацию C2′- endo , компенсируя десольватацию O2 и 2’OH cmo ⁵ U34 (голубой). В паре оснований cmo ⁵ U-C он принимает стандартную конформацию с водородной связью с 2’OH A35 в тРНК (оранжевый). (b, c) В паре оснований cmo ⁵ U-U U демонстрирует большее взаимодействие при стэкинге со своим 5′-основанием, чем C в паре оснований cmo ⁵ U34-C.

Пара оснований cmo ⁵ U34-C () принимает конформацию, аналогичную конформации cmo ⁵ U34-U и ранее наблюдаемым несовпадениям UC в дуплексах РНК, что позволяет образовывать одну водородную связь ^{17 18} . Расположение оснований предполагает, что обе позиции N3 должны быть десольватированы, и мы не видим молекулы воды, соединяющей их, как наблюдалось ранее ¹⁷ .В отличие от cmo ⁵ U34-U, пара cmo ⁵ U34-C не образует контакты G530, описанные выше, и оба основания имеют меньшее расположение (). Меньшее взаимодействие стэкинга, отсутствие контактов с G530, а также возможное отсутствие дополнительных водородных связей с карбоксильной группой модификации должны дестабилизировать тРНК ^Val _cmo5UAC с кодоном, заканчивающимся на C, относительно одного оканчивается на U. Это согласуется с биохимическими исследованиями тРНК валина и лейцина ^{19 , 20} .

ОБСУЖДЕНИЕ

В начале цикла элонгации рибосома кажется тонко сбалансированной, так что дополнительной энергии связывания от родственной, но не близкой к родственной тРНК, достаточно, чтобы вызвать конформационные изменения в активную форму, а не увеличить сродство тРНК ^{7 , 8} . Работа здесь обеспечивает структурное обоснование того, как модификация в положении колебания может обеспечить достаточную дополнительную энергию связывания, чтобы облегчить декодирование для всех четырех возможных пар оснований в положении колебания, что позволяет расширенное считывание кода одной тРНК.

Удивительно, но мы обнаружили стандартную геометрию пар оснований Watson-Crick не только для канонической пары U34-A, но и для пары U34-G. Почему в паре U34-G не наблюдается стандартной геометрии колебаний U-G? Ранее было показано, что G в положении 34 тРНК может принимать геометрию колебания с U на кодоне ⁹ . Однако во всех цитоплазматических тРНК обратное спаривание U34 на тРНК с G на кодоне происходит только тогда, когда U34 модифицируется (rev. Ref. ⁶ ).В стандартной геометрии вобуляции G-U U имеет улучшенное наложение со смежным основанием на его стороне 5 ‘, в отличие от основания на его стороне 3’ ^{21 , 22} . Таким образом, предпочтительна пара оснований G-U с U на 3 ‘, а не на 5′ конце цепи. Колебательная пара U34-G на конце спирали кодон-антикодон в рибосомном A-сайте, с U на 5’-конце тРНК, поэтому должна быть энергетически менее стабильной и, следовательно, предположительно не вносить достаточную энергию связывания для способствовать индуцированному конформационному изменению, необходимому для эффективного декодирования.В целом, оказывается, что присутствие модификации в достаточной степени снижает штраф за стабилизацию енольной формы, так что пара Watson-Crick cmo ⁵ U34-G с ее дополнительной водородной связью и повышенным стэкингом является энергетически предпочтительной конформацией. Это также объясняет важность cmo ⁵ U34. Немодифицированный U34 был бы вынужден принять стандартную геометрию колебания U34-G, потому что он не может принять енольную форму достаточно эффективно, и водородная связь с U33 не будет фиксировать его положение.Поскольку основание в мРНК удерживается на месте за счет его взаимодействия с G530, а также с C518 и S12, это потребует перемещения U34 в направлении большой бороздки и приведет к тому, что он будет полностью разложен (). Помимо роли модификации, для G в положении колебания кодона мы наблюдаем некоторую перекрестную укладку цепи между A35 в ASL ^Val _cmo5UAC и A или G в положении кодона колебания. Все тРНК, участвующие в декодировании шести упомянутых выше блоков вырожденных кодонов, содержат пурин в положении 35, что обеспечит дополнительную стабильность за счет перекрестного стэкинга для кодонов, оканчивающихся на A или G.M ⁶ A37 участвует в стопке поперечных цепей над первой парой оснований (дополнительный рис. 3 онлайн), которая сопоставима с t ⁶ A37 в ASL ^Lys _UUU ¹¹ ; это наложение также компенсирует низкую энтальпию связывания во всех четырех структурах.

В паре оснований U34-U карбоксильная группа модификации находится в пределах расстояния водородных связей O4 кодона. Однако pK _a карбоксильной группы в растворе близко к 3, предполагая, что он должен быть полностью депротонирован и, таким образом, не может образовывать водородную связь с O4 кодона.В соответствии с этим орбитали как карбоксильной группы, так и O4 кажутся ориентированными так, чтобы минимизировать отталкивание. С другой стороны, сдвиг на целых 5 единиц pH в pK _на карбоксильных групп наблюдался внутри ферментов ²³ . Таким образом, остается формальная возможность, что смещенный pK _a карбоксильной группы в cmo ⁵ U34 приводит к дополнительной водородной связи между модификацией на антикодоне и O4 кодона. Дополнительная водородная связь поможет объяснить предыдущие исследования, показывающие, что эффективность декодирования cmo ⁵ U34-U сравнима с эффективностью декодирования cmo ⁵ U34-G ¹⁹ .

Есть два дополнительных фактора, которые облегчают декодирование тРНК с cmo ⁵ U34 кодонов, заканчивающихся на U или в некоторых случаях даже C, даже если пара оснований cmo ⁵ U34-C кажется относительно слабой. В случаях, когда было показано, что одна тРНК декодирует все четыре кодона in vivo , спаривание оснований G-C происходило в первых двух положениях кодона. Пары G-C не только по своей природе более стабильны, чем пары A-U, но и A-минорное взаимодействие типа I для пар G-C также сильнее ²⁴ , обеспечивая, таким образом, дополнительную энергию связи.Эта дополнительная энергия от наличия пар G-C в первых двух положениях явно недостаточна для декодирования самого по себе, потому что, кроме того, требуется модифицировать U34. Мы ожидаем, что cmo ⁵ U34 предварительно структурирует антикодоновую петлю через водородную связь между 2′-OH U33 и O5 cmo ⁵ U34, тем самым предположительно снижая энтропийную стоимость связывания и, таким образом, делает связывание тРНК к кодону, оканчивающемуся на U или C, достаточно подходящему для декодирования в этих контекстах.

Наши структуры также согласуются с кинетическими экспериментами по декодированию в предустановленном состоянии, которые показали, что тРНК ^Ala с неканонической парой cmo ⁵ U34-C в положении колебания имела эффективность декодирования, аналогичную эффективности декодирования родственных тРНК, тогда как немодифицированная пара AG в положении колебания для тРНК ^Phe имела резко сниженную эффективность декодирования ²⁵ . Было бы полезно напрямую сравнить кинетические параметры для одних и тех же пар кодон-антикодон с модификацией и без нее.Наконец, структуры также согласуются с результатами, которые показывают, что аффинность связывания тРНК ^Val с модифицированным U34 с рибосомами с кодонами, заканчивающимися на A, G или U, очень похожа и сильнее, чем у кодона, заканчивающегося на C (EM Густило и П.Ф. Агрис, неопубликованные результаты).

Таким образом, работа, описанная здесь, обеспечивает структурную основу для рационализации давних наблюдений за тем, как модификации уридина в положении колебания способствуют расширенному декодированию тРНК.

МЕТОДЫ

Материалы и кристаллизация

Thermus thermophilus Субъединицы 30S рибосом очищали, кристаллизовали и криозащищали, как описано (конечный раствор составлял 26% (об. / Об.) MPD, 100 мМ K-MES, pH 6,5, 200 мМ KCl, 75 мМ NH ₄ Cl, 15 мМ MgCl ₂ ) ²⁶ . ASL ^Val _cmo5UAC был химически синтезирован с использованием слегка измененного химического состава фосфорамидита ²⁷ . Стандартные единицы и m ⁶ A были защищены типичной комбинацией маскирующих групп (5′-DMTr, 2′-TBDMS, экзоамин Pac / Bz), в то время как п-нитрофенилоэтил был использован для блокировки cmo ⁵ U карбоксильная функция.С олигомера была снята защита, как опубликовано ²⁸ , и гомогенность была подтверждена анализом MALDI-TOF, ферментативным расщеплением до нуклеозидов и анализом ВЭЖХ ²⁹ . ЯМР-анализ ASL ^Val _cmo5UAC четко продемонстрировал присутствие cmo ⁵ U34 и m ⁶ A37. Олигонуклеотиды мРНК были синтезированы химическим путем и очищены на геле (Dharmacon) с последовательностями 5′-GU (A / C / G / U) AAA-3 ‘(кодоны подчеркнуты). После криозащиты кристаллы 30S вымачивали в буфере для криозащиты, содержащем 80 мкМ паромомицин, 300 мкМ ASL и 300 мкМ соответствующего гексануклеотида мРНК, в течение не менее 48 часов, как описано ^{9 , 10} .Кристаллы мгновенно охлаждали в жидком азоте и хранили для сбора данных.

Сбор и уточнение данных

Кристаллы были предварительно проверены на канале ESRF ID14-2 с использованием коротких экспозиций, разнесенных на 90 градусов. Затем кристаллы хранились в жидком азоте перед сбором данных на каналах ESRF ID14-4 и ID29 в криопотоке при 90-100 К. Обработка проводилась с использованием XDS ³⁰ . Пакет CCP4 использовался для различных задач ³¹ . Coot использовался для визуализации и построения ³² и CNS 1.2 использовался для уточнения ³³ . Топологии и параметры использовались напрямую или были получены с помощью HIC-Up ³⁴ . Сводка кристаллографических данных представлена ​​на рис. Различия в отдельных наборах данных, вероятно, будут результатом небольших различий в качестве кристаллов. Рисунки, а также выравнивание между отдельными структурами были сделаны с использованием PyMOL ³⁵ . Структура спирали А-формы РНК, содержащей пару оснований GU-wobble, была выровнена по спирали антикодона кодона для сравнения с парой оснований cmo ⁵ U-G ³⁶ .Анализ взаимодействий стэкинга и валентных углов РНК проводили с использованием 3DNA ³⁷ .

Таблица 1

Сводка кристаллографических данных и уточнения